Иридоиды. Сравнение нони из разных регионов.

Определение и сравнительный анализ основных иридоидов в различных частях растения Morinda Citrifolia (нони) и местах его культивирования.

Авторы: Shixin Deng, Brett J. West, ’Afa K. Palu, C. Jarakae Jensen, Shixin Deng.
Адрес: Отдел научных исследований и разработок Tahitian Noni International, 737 East, 1180 South, American Fork, UT 84003, США.
Опубликовано: Phytochemical Analysis (Фитохимический анализ), 2011. Jan-Feb; 22(1): с. 26-30. doi: 10.1002/pca.1246. Epub 2010 Aug 26.
Источникwww.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20799271

Полный текст

Аннотация

Введение. Нони, как лекарственное растение с богатой историей использования и как народное средство во многих тропических районах, привлекает все большее внимание всего мира. Всеобъемлющее исследование по основному фитохимическому составу в разных частях растения (плоды, листья, семена, корни и цветки), и местах выращивания имеет большое значение для полного понимания его разнообразных лекарственных преимуществ.

Цель - количественно определить основные компоненты иридоидов в разных частях растения нони, и сравнить иридоиды в плодах нони, собранных из разных тропических районов по всему миру. Методология. Оптимальные условия хроматографии были достигнуты в пробирке C18 с градиентным элюированием, с использованием 0,1% водного раствора муравьиной кислоты и ацетонитрила при длине волны 235 нм. Метод жидкостной хроматографии высокого разрешения был выбран изходя из погрешности, линейности, предела обнаружения, предела количественного анализа и точности.

Результаты. Установлено, что основными иридоидами в плодах нони является деацетиласперулозидная кислота (deacetylasperulosidic acid, DAA). Определен порядок преобладания концентраций DAA в различных частях растения нони: дегидрированные плоды нони > сок из плодов нони > семена > цветки > листья > корень. Порядок преобладания концентрации асперулозидной кислоты (asperulosidic acid, AA) определен как: дегидрированные плоды нони > листья > цветки > корень > сок из фрукта > семена. Содержание DAA и АА в метанольном экстракте фруктов нони, собранных в различных тропических регионах колеблется от 13.8 до 42.9 и от 0.7 до 8.9 мг/г, соответственно. Плоды нони из Французской Полинезии (Таити) содержали самое большое общее количество иридоидов, плоды из Доминиканской Республики – наименьшее.

Выводы:

  1. Иридоиды DAA и АА, найденные в листьях, корнях, семенах и цветках растения нони, были определены как основные биологически активные действующие компоненты в нони.
  2. География сильно влияет на состав плодов, учитывая большие колебания содержания иридоидов в нони, выращенных в различных тропических районах по всему миру.
  3. Иридоиды в плодах нони являются маркером подлинности и качества при тестировании коммерческих продуктов из нони, так как оказались наиболее стабильными (не разрушаемыми) при температурах, используемых в процессе пастеризации.

Ключевые слова: Нони, Morinda Citrifolia, иридоиды.

Введение

Нони (Morinda Citrifolia Linn.) испокон веков является популярным лекарственным растением среди широкой области тропических регионов, таких как Южная Азия, Карибский бассейн и острова Тихого океана. В дополнение к хорошо известным плодам растения нони, его листья, семена, корни, и цветки также традиционно используются для лечения многих недугов, включая артрит, инфекции, рак, диабет, воспаления, боли и многих других (McClatchey, 2002;. Wang и др., 2002). Корни традиционно использовались в качестве слабительного и жаропонижающего средства, а также применялись наружно для обезболивания. Листья помогали для заживления язв и ран, вместе с плодами становились эффективны при проблемах горла, а также ушибах, фурункулах, и ранениях. (Anonymous, 1962).

В последнее десятилетие многие научные исследования были проведены на тему химических компонентов нони. В этом растении обнаружены аминокислоты, антрахиноны, жирные кислоты, флавоноиды, иридоиды, лигнаны, полисахариды, стерины, сахара и терпеноиды (Deng et al., 2007; Pawlus and Kinghorn, 2007; Potterat и Hamburger, 2007). Не смотря на то, что для плодов, листьев, корней, семян и цветов нони наблюдались различные химические профили, эти части растений могут иметь общие фитохимические компоненты, например, вездесущие флавоноиды. Кроме того, иридоиды, выделенные из плодов нони, листьев и корней, могут являться биохимической характеристикой разных частей растения нони, (Kamiya et al., 2005, 2008; Sang et al., 2001; Potterat et al., 2007; Samoylenko et al., 2006). Иридоиды обычно присутствуют в виде гликозидов, являясь важнейшим таксономическим биомаркером растений семейства Rubiaceous (Inouye и др., 1988), (Dinda и соавт., 2007a).

Растения, богатые иридоидами продемонстрировали широкий спектр биологической активности как в лаборатории (in vitro), так и в естественных условиях (in vivo) и в клинических испытаниях. В частности, противоартритное, противовоспалительное, антибактериальное, противогрибковое, противоопухолевое, антикоагулянтное, антиоксидантное, антивирусное, спазмолитическое, иммуномодулирующие, ранозаживляющие и нейропротекторное действия (Dinda и др., 2007b). В настоящее время остаются вопросы, касающиеся содержания и качества растущего числа коммерческих продуктов из нони (West и др., 2006; Palu и др., 2005). Таким образом, необходимы достоверные аналитические методы для проверки подлинности и контроля качества этих продуктов. Это исследование направлено на количественное определение основных иридоидов в разных частях нони (фруктов, листьев, корней, семян и цветков), и сравнительный анализ иридоидов в различных фруктах нони, культивируемых и собираемых по всему миру, используя метод HPLC-PDA (жидкостной хроматографии высокого разрешения).

Экспериментальная часть

Химические вещества и стандарты. Ацетонитрил класса HPLC (MeCN), метанол (метанол) и вода (H2O) были получены от фирмы Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури, США). Муравьиная кислота аналитического класса была приобретена у корп. Spectrum Chemical Manufacturing (Нью-Брансуик, штат Нью-Джерси, США). Кислоты DAA и AA, соответствующие химическим стандартам, были выделены из подлинных плодов нони в лаборатории Tahitian Noni International. Их идентификацию определяли с помощью HPLC, масс спектрометрии и ЯМР (чистота> 99%), в сравнении с литературой (Камия и др., 2008). Химические структуры DAA и АА приведены на рис. 1. Они были точно взвешены и затем растворены в соответствующем объеме метанола для получения исходного раствора. Рабочий стандартный раствор DAA и АА по калибровочной кривой был подготовлен путем разбавления исходного раствора с метанолом в семи концентрациях от 0,00174 до 1,74 и от 0,0016 до 0,80 мг/мл, соответственно. Все образцы исходного и рабочих растворов содержались при температуре 0°С в холодильнике. Калибровочные кривые стандартов были построены на основе линейной регрессии площади пиков концентрации.

Иридоиды AA и DAA

Рисунок 1. Химическая структура иридоидов: асперулозидная кислота (AA): R = Ac, деацетиласперулозидная кислота (DAA): R = H

Условия проведения хроматографии и измерительные приборы. Хроматографическое разделение проводили на разделительном модуле Waters 2690 в сочетании с 996 PDA детекторами, оснащенными пробирками C18 (4,6 х 250 мм, 5 мкм, Waters Corporation, Милфорд, штат Массачусетс, США). Насос был подключен по двум подвижным фазам: (A) MeCN, и (B) 0,1% муравьиной кислоты в H2O (v/v), и элюированых со скоростью потока 0,8 мл/мин. Подвижная фаза была запрограммирована последовательно в линейных градиентах следующим образом: 5 мин 0% A (100% B); и 40 мин 30% A (70% B). PDA детектор просматривался в диапазоне 210-400 нм. Частоты 235,5 нм и 235 нм были использованы для количественного определения DAA и АА. Для каждого образца вливался объем 10мл. Температура пробирки поддерживалась на уровне 25°C. Сбор данных и интеграция были проведены с использованием программы Waters Millennium версии 32.

Материалы и подготовка образцов. Свежий фруктовый сок Нони (образец A, рис. 2), выжатый из фруктов нони, первоначально собранных во Французской Полинезии (острова Таити). Один грамм свежего фруктового сока был разведен с 5 мл H2O-MeOH (1:1), и тщательно перемешан; проба была помещена в мерную колбу 5 мл для HPLC анализа. Сушеные фрукты, семена, корни, листья и цветы (образцы B-F, Рис. 2) были собраны с островов Таити. Они были перемолоты в порошок и дважды экстрагированы MeOH-EtOH (1:1) с ульразвуковой обработкой по 30 мин каждый раз. Экстракты были объединены, отфильтрованы и затем высушены в роторном испарителе в вакууме при температуре 50°C. Сухие экстракты были повторно растворены в метаноле для HPLC анализа. Сырые образцы фруктов нони (рис. 3) были собраны из разных областей, в том числе островов Таити, Тонга, Доминиканской Республики, Окинавы, Таиланда и Гавайев. Образцы фруктов хранились при температуре ниже 0 ° С до использования. Плоды нони были разморожены и превращены в пюре. Два грамма каждого образца пюре дважды экстрагировалась метанолом (125 мл, по 30 мин каждая) с использованием ультразвука. MeOH-экстракты высушены под вакуумом в роторном испарителе. Высушенные MeOH-экстракты снова растворяли в 10 мл метанола. Исходные образцы нони сохранены в лаборатории TNI.

Хроматограммы иридоидов

Рисунок 2. HPLC хроматограммы анализа иридоидов в различных частях растения нони. (А) сок нони; (B) высушенные фрукты (C) листья; (D) корни; (Е) семена; (F) цветы. DAA – деацетиласперулозидная кислота; АА – асперулозидная кислота. Ось х – время работы (мин), ось y – пик поглощения (АС).

Проверка аналитического метода. Пределы обнаружения (LOD) и квантификации (LOQ) были определены как наиболее низкие концентрации вещества в образце, которые могут быть обнаружены и измерены количественно. Данные пределы LOD и LOQ были определены на основе отношения сигнал-шум (S/N) 3:1 и 10:1, соответственно. Рабочие растворы эталонов DAA и АА для определения LOD и LOQ были подготовлены серийным разведением. Круглосуточный анализ точности, также как и тесты на стабильность, были выполнены с помощью указанного метода, выполняемого в течение трех дней подряд. Повторяемость является степенью соответствия результатов друг другу, когда условия эксперимента поддерживаются неименными настолько, насколько это возможно, и выражается как стандартное относительное отклонение (RSD). Уровни точности метода высокоэффективной жидкостной хроматографии были измерены с помощью трех вливаний эталонов в течение трех последовательных дней. Точность метода оценивали по проценту восстановления DAA и АА в образцах. В образцы сока нони были добавлены эталоны в трех различных концентрациях (эквивалентно 50, 100 и 150%-ной концентрации DAA и АА в образцах). Процент восстановления рассчитывался как соотношение обнаруженной концентрации (фактической) к эталонной (теоретическое). Изменение оценивали стандартное относительное отклонение (RSD) в трех экземплярах вливаний в экспериментах HPLC.

Анализ результатов

Проверка аналитического метода

Проверку разработанного метода хроматографии проводили на свежем соке Нони, чтобы определить LOD, LOQ, линейность и погрешность (Таблицы 1-3). Выбранные MeCN-H2O градиенты показали хорошее разделение и симметричные формы пиков целевых образцов в HPLC хроматограммах. LOD (S/N = 3) и LOQ (S/N = 10) получены 10,6 и 9,7 нг для  DAA; и 34,8 и 32,0 нг для АА. Уравнения линейной регрессии для DAA и АА были рассчитаны следующим образом: у = 1,443·107x – 17342,2, и у = 1,537·107x – 40804,7 соответственно, где х – концентрация и у – площади пиков. Результаты показали хорошую линейность с коэффициентами корреляциии 0,9994 и 0,9999 для DAA и АА, в диапазоне исследованных концентраций. Погрешности для DAA и АА были менее 0,86 и 3,0%, соответственно, что свидетельствует о стабильности концентраций в течение периода исследования. По установленным экспериментальным данным, процент возмещения эталонов DAA и АА были от 90,49 до 105,32%, при этом погрешность от 0.40-2.66% (табл. 3). Результаты экспериментов находятся в допустимых пределах, рекомендуемых  в руководствах для пищевых добавок, выпущенных  Ассоциацией Аналитических Сообществ [AOAC International, 2002]. Измерение количества иридоидов DAA и АА в образцах нони проводилось путем сравнения с эталонами их времен удержания и максимального поглощения излучения в HPLC (табл. 1).

Таблица 1. Хроматографические и спектроскопические характеристики иридоидов
Компонент ?max, нм Rt, мин LOD, нг LOQ, нг линейный диапазон, мг/мл
DAA 235.5 15.94 10.6 34.8 0.00174–1.74
AA 235 26.08 9.7 32.0 0.0016–0.80
DAA – деацетиласперулозидная кислота; АА – асперулозидная кислота

 

Таблица 2. Погрешность и стабильность при количественном определении иридоидов в нони методом HPLC-PDA
Образцы День 1 День 2 День 3 За пределами периода
Измер. объем1 СКО, % Измер. объем1 СКО, % Измер. объем1 СКО, % Измер. объем1 СКО, %
DAA 1.308 0.86 1.291 0.43 1.291 0.62 1.297 0.86
AA 0.276 1.16 0.281 3.00 0.287 1.84 0.281 2.49
1Значение ± стандартное отклонение (СКО), n = 3, мг/мл

 

Таблица 3. Точность при количественном определении иридоидов в нони методом HPLC-PDA
Образцы Введенная концетрация1 Измеренная концентрация1 Восстановление
процент % СКО,%
DAA 0.66 0.619 ± 0.016 93.84 2.66
1.32 1.271 ± 0.019 96.29 1.53
2.00 2.106 ± 0.009 105.32 0.40
AA 0.146 0.132 ± 0.002 90.49 1.58
0.291 0.273 ± 0.004 93.93 1.39
0.437 0.433 ± 0.004 99.25 0.93
1Значение ± стандартное отклонение (СКО), n = 3, мг/мл

 

Таблица 4. Концентрация основных иридоидов в разных частях нони
Образцы DAA1 AA1
Сок плодов, мг/мл 1.441 ± 0.027 0.218 ± 0.009
Высушенные плоды, мг/г 3.741 ± 0.016 1.253 ± 0.005
Листья, мг/г 0.338 ± 0.028 0.539 ± 0.007
Корни, мг/г 0.087 ± 0.008 0.326 ± 0.031
Семена, мг/г 1.303 ± 0.050 0.148 ± 0.011
Цветки, мг/г 0.880 ± 0.040 0.421 ± 0.021
1Значение ± стандартное отклонение (СКО), n = 3.

 

Характеристика и количественное определение DAA и АА в различных частях растения нони

Иридоиды были ранее идентифицированы в листьях и корнях нони. Согласно предварительным экспериментам, DAA и АА представляются основными иридоидами в большинстве частей растения нони в соответствии с их HPLC хроматограммами. Таким образом, эти два вида иридоидов были использованы для количественной оценки и сравнения содержания иридоидов в разных частях нони. Типичная HPLC хроматограмма фруктов нони, листьев, корней, семян и цветов представлены на рис. 2. Экспериментальные результаты (табл. 4) показывают, содержание DAA различных частях растения, в порядке преобладания, сушеные фрукты > фруктовый сок> семена > цветы > листья> корни. Содержание AA распределилось таким образом: сушеные фрукты > листья > цветы > корни> фруктовый сок > семена. Среди различных частей растения, фруктовый сок нони представляется хорошим источником иридоидов. Кроме того, в наших предыдущих экспериментах были проанализированы содержания в нони флавоноидов, лигнинов, антрахинонов и кумаринов (Deng и др., 2007, 2009, 2010). Эти исследования показали, что содержание иридоидов в нони, в частности деацетиласперулозидной кислоты (DAA) и асперулозидной кислоты (AA) выше, чем указанных компонентов. Испытания на токсичность DAA и АА показывают, что они не генотоксичны в клетках млекопитающих (Nakamura и др., 1997). Иридоиды DAA и АА проявили много видов биологической активности, включая антикластогенные, антиартритные, антиноцицептивные, противовоспалительные, сердечно-сосудистые, онко-профилактические и противоопухолевые эффекты (Nakamura и др., 1997;. Li и др., 2006;. Kim и др., 2005;. Liu и др., 2001;. Choi и др., 2005). Таким образом, согласно исследованиям, именно эти иридоиды способствуют столь разнообразным положительным эффектам для здоровья.

Сравнение содержания иридоидов в плодах нони из различных тропических районов

Чтобы оценить влияние географической среды (почва, солнечный свет, температура, осадки и т.д.) на содержание иридоидов в плодах нони, были проведены анализы фруктов нони, собранных из различных тропических регионов по всему миру. Спелые образцы плодов нони хранились в замороженном виде во время транспортировки. Кроме того, для контроля вариаций влажности были проанализированы метанольные экстракты. На рис. 3 показано сравнение DAA, АА и общего количества иридоидов (DAA + AA) в различных фруктах нони. Диапазоны концентраций DAA и АА в экстрактах MeOH были 13.8-42.9 и 0.7-8.9 мг/г, соответственно. Фрукты нони, собранные на территории Французской Полинезии, показали самое большое общее количество иридоидов, а образцы из Доминиканской Республики – наименьшее. Результаты показывают, что географические факторы оказывают значительное влияние на содержание иридоидов в плодах нони. Таким образом, от плодов нони собранных из разных областей можно ожидать разную степень фармакологической активности.

Сравнение нони по регионам

Рисунок 3. Сравнение содержания иридоидов в метанольном экстракте плодов нони, собранных в различных тропических районах по всему миру; деацетиласперулозидная кислота (DAA); асперулозидная кислота (AA), общее количество иридоидов (DAA + AA).

Влияние пастеризации на содержание DAA

Фруктовый сок нони, как правило, подвергается термической пастеризации при промышленной переработке. Пастеризация, применяемая в этой индустрии, предполагает нагрев до 87,7°С в течение нескольких секунд. В этом исследовании была определена стабильность DAA. Произведен нагрев до 90 ° С при рН 3,3 в течение 1 минуты, чтобы определить его термоустойчивость в кислой среде. Результаты показали, что в содержании DAA до и после нагревания не было никаких отличий, что доказывает устойчивость DAA в условиях пастеризации.

Выводы

  • 1. Для анализа иридоидов в различных частях растения нони и местах его культивирования разработан и утвержден метод селективной аналитической хроматографии высокого разрешения (HPLC).
  • 2. Иридоиды, в частности деацетиласперулозидная (DAA) и асперулозидная (AA) кислоты определены как основные биологически активные компоненты в плодах нони и также присутствуют в листьях, корнях, семенах и цветках растения.
  • 3. Географические факторы сильно влияют на содержание иридоидов во фруктах.
  • 4. Иридоиды в нони стабильны в процессе пастеризации до 90°С.

Таким образом, описанный метод предоставляет точный и быстрый инструмент качественного и количественного анализа нони и коммерческих продуктов из него.

Проголосуйте за статью в один клик:

st

Понравилась статья? Поделитесь с друзьями:

Присоединиться в друзья:

Комментировать

Cайт Наука Нони:
Новости Нони
Ваше имя: *
Ваш e-mail: *
Облако меток